His标签融合蛋白的纯化

His-tag融合蛋白纯化是目前最常见的一种表达方式。优点是表达方便且基本不影响蛋白的活性，无论表达的蛋白是可溶性的或是包涵体都可以采用固定金属离子亲和色谱（Immobilized metal-ion affinity chromatography，IMAC）去纯化。

IMAC，又称金属螯合亲和层析，是近20年来发展起来的一种新型亲和层析技术。与其他亲和层析技术相比，IMAC的优点在于配体稳定性高、吸附量大、洗脱条件温和、高通量、柱再生能力强以及成本低等。IMAC不仅可用于蛋白质或肽的分离纯化，也可用于寡核苷酸的分离、病毒的灭活以及从蛋白制备物中去除内毒素等，应用十分广泛。

IMAC应用于蛋白纯化时会受到很多因素影响，下文对影响IMAC纯化效果的因素进行了分析。

影响IMAC纯化效果的因素

1. 填料的种类

根据具体情况选择合适的填料，如表1所示。然而实际实验中很难找到一种填料适合所有6个组氨酸标签蛋白的纯化，因为载量高和特异性好之间难以协调。最简单的办法就是用填料螯合相同的金属离子，颜色深者意味着与蛋白的作用力强，适用范围广。

表1 纯化填料

2. 金属离子种类

螯合金属离子和蛋白相互作用强弱为Cu²⁺和Ni²⁺的强，而Zn和Co²⁺的弱。因此，如果一个蛋白的作用力强，要想得到较高的特异性，可以选择螯合Co²⁺。此外，螯合金属离子的价位越低与蛋白的作用力越强。Ni²⁺是最常用的金属离子，其主要是通过Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。

3. 蛋白自身结构

通常带组氨酸标签的蛋白在天然条件下均可以被镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶吸附，但如果标签折叠在蛋白内部不容易暴露，这样就难以纯化。实验中可以通过向样品中加入适量脲或盐酸胍，改变蛋白结构的松散程度从而达到吸附蛋白的目的。

4. 缓冲体系，PH及盐浓度

对于一些作用力弱的蛋白不能选择带氮原子的缓冲体系，但可以选择Tris-Hcl等，适当提高缓冲液PH以增加吸附效果。而降低PH可以洗脱一些咪唑洗不去的杂带。此外，加入适量NaCl可以避免电荷的干扰作用。

5. 表面活性剂及其他添加剂

添加一些表面活性剂可以增加蛋白的溶解度，降低疏水作用，从而使得蛋白纯化效果更好。在实验中，可通过向平衡缓冲液中加入0.5-1%的吐温使电泳的背景更清晰，杂带更少。

IMAC方法已经成为用于简易纯化含有组氨酸标签蛋白的常用方法。它不仅可以减少纯化步骤，还能产生所需质量和高纯度的蛋白产品。尽管目前仍有一些技术问题需要研究和解决，但相信IMAC必将成为生物大分子分离纯化的有力工具。